2024年4月25日，美国得克萨斯州西南医学中心吴军团队、中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（中科院神经所）杨辉/周海波团队和中科院动物所郭帆团队合作在Cell杂志发表题为Generation of rat forebrain tissues in mice的文章。该研究展示了一种优化的囊胚互补技术，利用该技术研究者筛选出了支持前脑囊胚互补的基因Hesx1，并成功在小鼠体内生成了功能性大鼠前脑组织。异种前脑互补为研究大脑发育以及认知功能机制在进化上的保守和差异性打开了大门。优化的囊胚互补策略具有极大的潜力，可以拓宽异种器官生成的研究和应用。

异种嵌合体是由不同物种细胞所形成的生物个体，是理解基因功能和细胞发育机制的重要工具。通过一种称为异种囊胚互补的技术（Interspecies blastocyst complementation, IBC）研究者能够在动物体内培育其他物种的器官。这项技术涉及将供体多能干细胞注入缺失关键发育基因的宿主囊胚中，让供体细胞补偿宿主缺失的器官或组织，从而在一个物种里生成来源于另外一个物种的器官。之前的研究在小鼠中生成了大鼠的胰腺、胸腺、血管内皮组织和生殖细胞，以及在大鼠中生成了小鼠的胰腺、肾脏和生殖细胞。然而，到目前为止，还没有实现任何大脑组织的异种囊胚互补。在一个物种体内生成另一个物种的大脑组织不仅可以使研究者在进化背景下进行大脑发育和功能的研究，还能为人类多能干细胞对动物大脑的贡献所引起的伦理问题提供参考。

传统的囊胚互补方法通常需要生成影响特定器官发育的杂合突变小鼠，扩繁这些小鼠以获得基因突变的囊胚，然后向这些突变囊胚里注入供体细胞以获得囊胚互补嵌合体。这一过程耗时耗力且不适用于杂合突变致死的基因。到目前为止，尚未发现能够支持异种前脑囊胚互补的基因。利用传统囊胚互补方法来验证某个基因是否支持前脑的囊胚互补是一个漫长的过程，即使对于孕期短和性成熟快的物种（例如，小鼠为10至26个月）。这对于繁殖周期更长的家畜和非人类灵长类动物来说更加困难。

为了克服现有囊胚互补方法的局限性，研究者引进了C-CRISPR方法（Cocktail of targeting sgRNAs in the CRISPR/Cas9 system）以高效获得基因突变囊胚，该方法使用多个gRNA与Cas9结合可实现目标基因接近100%的基因敲除效率。研究者将C-CRISPR与Blastocyst Complementation相结合构建了新的囊胚互补系统CCBC。CCBC支持快速测试目标基因是否适用于囊胚互补，并实现器官重构嵌合体的一步生成。

在早期脊椎动物胚胎发生过程中，脑部形成依赖于Wnt/β-catenin信号传导。研究者使用CCBC对七个在脑发育期间调节Wnt信号传导的基因进行了筛选。所有候选基因都可以被C-CRISPR有效地删除，但只有Dkk1、Hesx1和Six3的敲除会导致前脑发育不全。在将小鼠胚胎干细胞（Mouse embryonic stem cells, mESCs）注入各个基因删除的囊胚后，研究者在Dkk1-/-和Hesx1-/-的胚胎中观察到重构的的同种异体前脑组织。在68只Hesx1-/- +mESCs新生嵌合体中，研究者获得了66只（97.06%）前脑重构嵌合体。在Hesx1-/- +mESCs嵌合体中tdTomato+细胞在前脑的比例（约100%）高于传统嵌合体（WT+mESCs）（约50%）。未受Hesx1敲除影响的中脑区域的嵌合率接近50%。这些发现显示了供体mESCs完全补偿了缺失的宿主前脑。

为了确定是否可以通过CCBC在小鼠中生成大鼠前脑组织，研究者将大鼠胚胎干细胞（Rat embryonic stem cells，rESCs）注入到Hesx1-/-小鼠囊胚中。在出生的417只Hesx1-/- +rESCs嵌合体中，401只为部分前脑重构（96.16%），16只为完全前脑重构（3.84%）（图1A）。研究者发现，在Hesx1-/- +rESCs嵌合体中，tdTomato+细胞的比例在皮层和海马区比其他脑区和其他组织更高（图1B）。

图1.通过CCBC在小鼠体内生成大鼠前脑组织。A: 基于CCBC的异种前脑互补嵌合体；B: 表达tdTomato的大鼠细胞对前脑组织的嵌合占比。

所有Hesx1-/- +rESCs和Hesx1-/- +mESCs嵌合体都存活至成年，并呈现与传统嵌合体（WT+mESCs）类似的体重增长曲线。在这些嵌合体的大脑皮层V层和海马中，均检测到表达CTIP2的细胞。各组嵌合体的皮层和海马层厚度和细胞密度均相似。
为了评估来自rESCs的神经元的功能，研究者将AAV8-hSyn-EGFP注入到Hesx1-/- +rESCs前脑的前外侧运动皮层。研究者发现由rESC衍生的前脑神经元能够向后发送轴突投射到丘脑、上丘和脑干中脑区域。电生理结果显示，在嵌合前脑中，大鼠和小鼠的皮层神经元均能够随电流注入量的增加产生不同频率的动作电位发放。此外，包括输入电阻、静息膜电位和启动电流在内的固有生理特性在两种细胞类型之间无显著差异。研究还确认，在Hesx1-/- +rESCs嵌合体中，大鼠和小鼠细胞、小鼠与小鼠细胞、大鼠与大鼠细胞之间均能形成突触连接。。统计发现同种或异种神经元之间的突触形成比例无显著差异。

研究通过行为学测试，包括Morris水迷宫实验、开放场测试和情境恐惧记忆测试，评估了同种和异种前脑补偿嵌合体的前脑功能。测试结果显示，WT+mESCs、Hesx1-/- +rESCs和Hesx1-/- +mESCs嵌合体在这些行为测试中的表现无显著差异，显示重建的前脑功能表现正常。这些结果表明Hesx1-/-小鼠胚胎为供体rESCs提供了适宜的发育环境，帮助其形成功能性的大鼠前脑组织。

单细胞RNA测序显示，在Hesx1-/- +rESCs嵌合体中，大鼠细胞形成了多种类型的神经细胞，种类和比例接近于正常大鼠的前脑组织。不同神经细胞类型下大鼠细胞的转录组更接近于WT大鼠细胞。有趣的是早期胚胎的切片结果显示大鼠细胞形成的前脑组织的尺寸和发育进度与宿主小鼠一致。这表明非细胞自主机制决定了器官的大小和发育速度，而细胞自主机制塑造了嵌合体中大鼠前脑组织的整体转录组特征。
通过比较大鼠细胞在嵌合体与WT大鼠中的转录组差异，研究者发现了一些与轴突生成、前脑发育和神经生成调控等相关的差异表达基因。通过细胞相互作用分析，该研究观察到了多种潜在的配体-受体相互作用，这可能解释了宿主Hesx1-/-小鼠细胞如何影响供体大鼠细胞，以及帮助它们在前脑中的存活和分化。

综上所述，该研究开发了一种高效快捷的一步CCBC平台，证明了在小鼠囊胚中敲除Hesx1能够支持小鼠和大鼠干细胞重构前脑组织。展示了来源于rESC的神经元能在小鼠前脑中功能性地整合。揭示了异种前脑补偿嵌合体里脑组织的尺寸、密度发育速度与宿主一致，在转录组水平上大鼠细胞在小鼠胚胎里仍能维持自身的转录组特征。异种前脑囊胚互补将为探索脑相关基因调控网络、脑细胞间通信以及在进化背景下大脑功能开辟新的路径。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.03.017

校友简介

杨辉，生命科学技术学院2007届本科校友，中国科学院生物化学与细胞研究所博士，美国Whitehead研究所博士后。国家杰出青年科学基金、何梁何利基金，优秀青年科学基金、青年千人基金、上海市青年拔尖人才等获得者。