近日，上海交通大学生命科学技术学院林双君教授、戴少波长聘教轨副教授、上海交通大学医学院张健教授团队合作在国际知名期刊《Nature Communications》发表题为“A three-level regulatory mechanism of the aldo-keto reductase subfamily AKR12D”的研究论文。作者在研究泰乐菌素生物合成机制与高产优产过程中，鉴定了一个新型醛酮还原酶亚家族AKR12D成员AKRtyl，并通过晶体结构解析、稳态/瞬态动力学测定及分子动力学模拟等揭示了其应对辅因子和底物的复杂三重调节机制（图1）。上海交通大学生命科学技术学院博士生肖志宏为论文第一作者，上海交通大学生命科学技术学院林双君教授、戴少波长聘教轨副教授和上海交通大学医学院张健教授为该论文通讯作者。

图1. 辅因子和底物介导的AKRtyl三重调节机制

变构调节指蛋白、核酸等生物大分子受到配体、离子、互作大分子等效应物刺激后通过构象、动力学、热力学变化等方式对信号做出响应以及将信号传递给远端位点的调节方式。变构调节是生物大分子的固有性质，在几乎所有生命体中发挥重要作用，被称为“生命的第二个秘密”。经过六十年的发展，学术界对变构调节的机理、模型都有了深刻认识，然而它仍然充满着神秘，例如，在多配体体系中，生物大分子如何响应多种、且不同水平信号刺激的复杂分子机制仍然不清楚。醛酮还原酶（AKR）是一类能将羰基还原成伯醇/仲醇的氧化还原酶，分布于所有物种中，在生物体中大多扮演解毒脱毒的角色，目前AKR超家族包含17个家族及61个亚家族。早期的一些研究发现不同配体结合会对AKR的稳定性产生不同的影响，暗示其中可能存在变构调节，但是缺乏结构和生化等支撑证据。

本研究作者在tylosin产生菌中挖掘出一个NADPH依赖的底物广谱性醛酮还原酶AKRtyl，序列分析显示该酶属于一个新的醛酮还原酶亚家族AKR12D，功能验证发现AKRtyl能还原tylosin为副产物relomycin。有意思的是，稳态动力学测定揭示出AKRtyl的两个不寻常特性：辅因子NADPH 对 AKRtyl表现为自抑制（Ki=148.6 μM），而底物tylosin表现为正协同（希尔常数n>1）。（图2）

图2. 新型亚家族还原酶AKRtyl对辅因子和底物的动力学特征

为了探究不同动力学性质的分子基础，作者解析了AKRtyl的一系列高分辨率晶体结构，揭示了AKRtyl在不同配体及不同水平下的结构特征，并提出了AKRtyl的三级结构调节机制模型：

(1) NADPH的变构调节：低辅因子浓度下（微摩尔级别），NADP(H)能诱导AKRtyl功能结构模块从无序的dormant构象（T：休眠构象）转变为active构象（R：活性构象）。值得注意的是，虽然AKRtyl的真实寡聚状态为八聚体，但作者发现只有四聚单元表现出不依赖于辅因子的T和R构象平衡，并且四聚单元在不同配体状态下（无配体、部分配体、全配体）总是表现出对称的结构特征，这些都符合Monod-Wyman-Changux （MWC）模型（又称为齐变模型、对称模型）的特点，因此作者提出该调节模型是一种以四聚体（半寡聚态）为单元的非典型的MWC别构调节模型。（图3）

图3. AKRtyl结合NADP(H)的非典型MWC别构调节模型

(2) NADPH的自抑制：高辅因子浓度下（亚摩尔级别），作者发现AKRtyl的每个亚基可结合两分子NADPH，第一分子NADPH结合在常规辅因子结合口袋，而第二分子NADPH占据了底物结合口袋，阻遏底物上载从而抑制反应，因而导致稳态动力学上表现自抑制现象。（图4）

图4. 抑制型NADP(H)占据底物结合口袋

(3) 底物tylosin的变构调节：作者在AKRtyl-NADP+-tylosin三元复合物结构中惊讶地发现，每个亚基结合两分子tylosin，其中第一分子tylosin结合在底物口袋，而第二分子tylosin结合距离活性口袋15 Å（反应原子距离25 Å）的远端位点，破坏该位点的结合会导致动力学正协同性降低或消失，因此作者推测第二分子tylosin以变构调节剂的角色结合在该位点。通过分子动力学模拟，进一步发现变构tylosin的结合会促进活性口袋附近loop运动，从而促进活性口袋打开促进AKRtyl对tylosin的还原。

图5. AKRtyl结合两分子tylosin - 活性位点底物和远端变构调节剂

最后，作者发现AKR12D亚家族中存在众多与AKRtyl高度保守的序列（包括与多重结构调节相关的位点），这些序列广泛分布于链霉菌中，作者以天蓝色链霉菌S. coelicolor A3(2)和白色链霉菌S. albus J1074中对应的AKR为代表，验证了辅因子抑制、底物正协同性在属于该亚家族的链霉菌AKR中广泛分布。另外，基于所有AKR高度相似的三级结构特征，作者进一步研究发现不同物种的底物广谱的AKR都表现出普遍的底物正协同性质。进而推测，多重调节方式可能可以赋予酶对胞内不同配体水平及氧化还原水平的应对能力。

综上，作者系统阐述了一个新型醛酮还原酶亚家族成员AKRtyl应对不同水平下的辅因子、底物的三级调节机制，为自然界广泛的多配体系统的互作方式提供了新见解，也为变构蛋白改造和变构药物设计提供了指导。

该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、海河合成生物学实验室重大专项、上海市优秀学术带头人项目的支持。感谢国家蛋白质科学中心上海同步辐射光源（SSRF）的结构生物学研究平台的支撑。感谢上海交通大学医学院博士生查锦寅在分子动力学模拟方面做出的贡献，感谢上海交通大学生命科学技术学院郑舰艇老师团队在结构生物学方面提供的指导和帮助，感谢华东师范大学何晓教授团队提供的计算机时。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-46363-z