近日，上海交通大学生命科学技术学院张大兵团队杨立桃课题组，在生物传感器领域权威期刊《Biosensors and Bioelectronics》(IF: 10.618)在线发表了题为“PAM-free Loop-mediated Isothermal Amplification Coupled with CRISPR/Cas12a Cleavage (Cas-PfLAMP) for Rapid Detection of Rice Pathogens”的研究论文，首次结合核酸固相提取、LAMP等温扩增、CRISPR/Cas12a体外剪切和免疫试纸条，建立了一种现场快速核酸检测技术体系Cas-PfLAMP，并成功应用于田间水稻病原体（水稻白叶枯病，XOO；水稻条纹病毒病，RSV；水稻黑条矮缩病，RBSDV）快速检测。上海交通大学生命科学技术学院博士研究生朱早兵为本文的第一作者，生命科学技术学院杨立桃教授为通讯作者。

水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的粮食作物之一。然而，水稻常见的病害，如：水稻白叶枯病（XOO）、水稻条纹病毒病（RSV）和水稻黑条矮缩病（RBSDV）等严重影响着水稻产量和稻米品质，尤其是在中国、韩国和日本等亚洲国家。关于水稻病原菌的预防和快速诊断研究，前人已经报道了多种检测方法，如：生物接种法、电子显微镜法、荧光的免疫分析法、基于抗体的血清学诊断、荧光定量PCR法、重测序法等，然而，这些技术方法对于水稻病害预防和检测存在一定不足，如：检测周期长、准确性差、灵敏度低等。

近年来，基于成簇的规则间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR/Cas）系统被广泛应用于基因组编辑和核酸检测领域。CRISPR/Cas12a (Cpf1)等具有反式切割活性（trans-activity）以及向导RNA (sgRNA)的双链DNA的特异性识别和切割活性的特点，为新一代快速核酸检测技术开发打开了一扇门。如：张锋教授团队的夏洛克检测系统SHERLOCK(Cas13)，Doudna教授团队的DETECTR系统(Cas12 or Cas14)，王金/赵国屏教授团队开发的HOLMES系统(Cas12)等。

该研究，作者开发了一种不依赖于间隔区相邻基序(PAM)、CRISPR/FnCas12a剪切辅助的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）检测技术，Cas-PfLAMP。Cas-PfLAMP巧妙的结合了LAMP等温扩增、FnCas12a蛋白的反式切割活性的优点，有效提高了Cas-PfLAMP检测的灵敏度和特异性，克服了传统的LAMP检测假阳性高的缺点。该研究以三种水稻病原体（XOO，RSV，RBSDV）为对象，设计了病原菌特异性的引物和sgRNA，系统评价了Cas-PfLAMP技术的特异性、灵敏度和准确性，结果表明Cas-PfLAMP能够准确区分三种水稻病原菌，灵敏度达到了3-9个拷贝/反应。

Cas-PfLAMP工作原理示意图

同时，研究人员还发明了一种适合于植物叶片核酸固相提取新方法，将DNA/RNA固定在叶片组织上，在5~10分钟内可以完成96个水稻叶片样本的核酸固相提取。研究人员将Cas-PfLAMP技术、固相核酸提取方法、侧向流动试纸条(LFS)优化组合，搭建了一套田间快速可视化检测平台，并成功用于田间3种水稻病原体（XOO，RSV，RBSDV）的现场检测。从样本采集，核酸提取，到最后结果读出，全程检测时长约为60分钟。田间样本测试结果与常规的PCR检测结果完全吻合，证明了Cas-PfLAMP在田间快速检测时具有准确性高、特异性好。研究结果表明，Cas-PfLAMP检测系统性能优良，不仅适用于水稻病原体的现场快速检测，还可以进一步扩展应用于其他植物病原体、动物疫病等核酸检测领域。该研究也为核酸分子快速、可视化检测提供了新的思路。

Cas-PfLAMP田间快速可视化检测平台工作流程示意图

该研究得到了上海交通大学农业与生物技术学院陈功友教授、江苏省农科院周彤研究员的大力帮助，还获得了上海市科委农业科技领域项目和上海高校特聘教授（东方学者）项目的支持。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566322001166