2022年2月4日，NEW PHYTOLOGIST在线发表了上海交通大学生命科学技术学院/代谢与发育科学国际合作联合实验室袁政教授课题组题为“A rice single cell transcriptomic atlas defines the developmental trajectories of rice floret and inflorescence meristems”的研究论文。研究人员利用单细胞测序系统绘制了水稻花序早期发育的动态全景图，重建了水稻小穗、花和各类生殖分生组织的发育轨迹。通过分子和遗传分析，明确WOX转录因子DWT1在调节水稻花分生组织活性中发挥功能；证明了生长素转运蛋白OsAUX1在花序发育中的作用，为生长素调控水稻花序分枝提供了直接的遗传证据。上海交通大学生命科学技术学院博士生宗杰、王丽、朱璐为并列第一作者，袁政教授为通讯作者。上海交通大学张大兵教授，梁婉琪教授、上海市农业科学院作物育种栽培研究所曹黎明研究员、马普研究所George Coupland院士等参与了本项研究的实施。

水稻是人类重要的粮食作物之一，在我国粮食生产中占有重要的地位。水稻花序的形态结构是直接决定最终产量的重要农艺性状之一。水稻花序发育和形态建成包括花序分生组织（IM）、一次和高次枝梗分生组织（BMs），小穗分生组织（SpM）以及花分生组织（FM）等多类生殖分生组织活性的调节、属性转换，以及花器官属性建立和形态建成等发育事件，受外在环境条件和内在遗传因子等多方面因素调控。但人们对IM、BMs、SpM和FM之间的形态和分子差异，以及它们在发育中的细胞水平差异仍不甚了解。近年来，多家实验室使用单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）研究了拟南芥、玉米、水稻等材料根、茎和叶等组织的细胞特性和异质性，不仅在单细胞分辨率上提供了有价值的转录组学信息，还对这些器官的发育轨迹提供了前所未有的见解，也为开展植物花序和花器官的发育轨迹分析提供了新的契机。

该研究以2个含盖水稻花序早期发育各生殖分生组织转换、花器官属性建立等发育过程的样本S1（花序长度<2mm）、S2（花序长度2-3mm）和剑叶（对照）进行了单细胞测序（BD RhapsodyTM，上海烈冰），获得了包含37,571个高质量细胞的单细胞转录组数据，并将这些细胞分为小穗、分生组织、花序轴和叶四大细胞类群（图1）。研究人员进一步对小穗、花、分生组织亚群进行了细胞类群鉴定和全面的分析，并通过原位杂交、分子标记转基因植株和突变体分析验证了分类的正确性。

图1.水稻花序早期发育模式图及细胞分类

(a) 水稻花序早期发育模式图。(b) 实验流程，展示花序早期发育两个时期材料的取材、原生质体收集、细胞捕获、单细胞转录组测序和生物信息学分析的工作流程。(c) t-SNE分类算法将花序细胞分为小穗、分生组织、轴、叶四大类群。(d) AUROC（area under the receiver operator characteristic curve）分析展示样本之间的高重复性。

鉴于学者前期在水稻小穗和花发育中已经克隆了较多的调控因子，为细胞分群提供了可用的标记基因。研究人员首先对小穗和花细胞进行了细分研究。其中花的细胞类群可以分为10类，根据分子标记和拟时序分析，研究人员不仅鉴定到护颖（extraordinary glum, eg）、不育外稃（sterile lemma, sl）、外稃（lemma, le）、内稃（palea, pa）、浆片（lodicule, lo）、雄蕊（stamen）等已知花器官细胞类群，还发现了小穗属性细胞（SIC）、FM、边界细胞（boundary）、隐性孢片（cryptic bract）等新的细胞类群（图2）。研究人员发现ROC/HDG家族基因在SIC中富集，在拟时序分析结果中位于花器官发育的起点（图2）。研究还发现，WOX类转录因子DWT1在FM中高富集，是FM的标记基因；遗传学分析揭示DWT1基因突变的确会造成内稃、浆片属性和数量的异常，证实DWT1具有调控水稻FM活性的功能（图2）。

图2.水稻花细胞类型分类和dwt1突变体表型

(a) 水稻花的UMAP图，显示10个花细胞亚分群。红色和蓝色箭头表示花细胞的两条发育轨迹：生殖器官（FM、pa、lo、st等花组织）和非生殖器官（cb、le、sl, rg等苞叶类附生组织）。(b) 小穗和花结构示意图。(c) DWT1在FM中高富集。(d) 野生型9522小穗的表型。(e) dwt1突变体花表现出内稃异常(e1)或缺失(e2)、多雌蕊(e3)、和伸长的颖片状浆片(e4，e5)等表型。

通过拟时序分析，研究人员进一步构建了花发育的两条途径，并在单细胞表达组学层面证明水稻“真正的”花是以SIC–FM–pa/lo/st模式发育，而rg、sl、le是苞片状器官的观点（图3）。通过原位结果验证，ROC/HDG家族基因高度富集的SIC细胞群处于SpM和FM的表皮层（L1），暗示花分生组织L1在花分生组织活性调控和后续发育中发挥重要功能；研究人员由此提出ROC/HDG基因家族可能提供来自FM外层的位置信号，以激活水稻小穗和花启动的假设（图3）。

图3.水稻花细胞拟时序分析和SIC-FM发育模型

(a)和(b) 花细胞的拟时序分析结果，显示FM细胞会发育成花器官，包括不含叶属性细胞的内稃、浆片和雄蕊(a)，和包含叶属性细胞的护颖、隐性苞片和边界细胞(b)。(c) 小提琴图显示ROC基因在花SIC中富集。(d) ROC1 (d1)、ROC3 (d2)的mRNA原位杂交显示SIC为花序原基表皮细胞。(e) 小穗中SIC、SSC（支撑细胞群）和FM之间关系的模型图。

研究人员随后对生殖分生组织再次进行细胞类群细分，将分生组织细胞簇分为花序分生组织、分枝分生组织和小穗分生组织三类，并提供了一系列全新的细胞类型标记基因（图4）。研究通过拟时序重建了各类生殖分生组织的发育途径，并确定了四类控制侧生分生组织转变的调节因子。研究人员还深入分析了第二类代表基因OsAUX1的表达模式和生物学功能，证实Osaux1突变体花序变小、分枝和小穗数量减少的表型，为生长素调控水稻花序发育提供了直接的遗传学证据（图4）。

图4.水稻花序分生组织细胞类型鉴定和拟时序分析，以及OsAUX1调控花序分枝的表型

(a) 花序分生组织细胞的UMAP图，分为3种细胞类型：IM、BM、SM。(b) 对分生组织细胞进行拟时序分析，展示了从IM到BM和SM的两条分化轨迹。(c) 对(b)图中红色节点的BEAM分析显示转录因子对分生组织转化的贡献分为四大类。(d) OsAUX1基因BEAM分析散点图，表示OsAUX1主要影响IM向BM的分化。(e) OsAUX1在S1时期的原位杂交结果，显示OsAUX1在BM和SM中表达。(f) 与野生型9522相比，Osaux1-1;4突变体花序显示较短的分枝和较少的小穗数。(g) 与野生型相比，Osaux1-1;4突变体花序的长度变短。

这些研究成果系统绘制了水稻花序早期发育的单细胞图谱，重建了水稻花和生殖分生组织的发育轨迹，明确了花序发育过程中的一系列重要调控因子并提供了遗传学证据，为今后解析水稻花序发育的精细过程和分子机制，以及水稻高产育种奠定了良好的基础。

该项目获得了国家自然科学基金、杂交水稻国家重点实验室开放课题、上海市水稻产业技术体系建设、高等学校学科创新引智计划、上海交通大学SMC晨星计划等项目经费的支持。

论文链接：

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/nph.18008