近日，上海交通大学生命科学技术学院/微生物代谢国家重点实验室的吴更教授团队与武汉大学王连荣、陈实教授团队合作，通过对沙门氏菌中的抗噬菌体防御蛋白DndI的X射线晶体结构解析，阐明了DndI采用其C端的HNH核酸酶结构域对外源噬菌体DNA进行缺刻损伤，同时采用其N端结构域识别细菌基因组上的DNA磷硫酰化修饰，触发DndI的构象变化，使得DndI从细菌基因组DNA上解离，从而保护细菌自身的基因组DNA不被DndI切割的分子机理。这项研究加深了人们对于细菌如何利用DNA磷硫酰化修饰来抵御噬菌体侵染的认识。该研究成果以“Molecular and structural basis of the phosphorothioationsensing antiphage defense system IscS-DndBCDE-DndI”为题发表在《Nucleic Acids Research》上。吴更与王连荣、陈实教授为共同通讯作者。本文是吴更教授自2018年在Nature Communications发表的细菌通过SBD结构域识别硫修饰DNA的结构机理、2020年在Nature Microbiology发表的参与单链DNA 硫修饰的SspB、SspE蛋白结构、2020年在mBio发表的参与单链DNA硫修饰的SspA结构、2022年在mBio发表的参与双链DNA硫修饰的DndE结构、2022年在Nature Communications发表的DNA硫修饰激活SspE以抵御噬菌体侵染的结构机理、2022年在Nature Catalysis发表的细菌通过DndFGH复合物限制外源非硫修饰DNA水平转移的分子机理的延续与拓展。

在细菌中dndBCDE操纵子编码的几个蛋白以及半胱氨酸脱硫酶IscS共同催化DNA上磷硫酰化修饰的发生。dndI基因紧邻于dnd操纵子，dndI基因的缺失会导致细菌丧失抵御噬菌体感染的能力。我们首先通过解析沙门氏菌DndI全长蛋白的X射线晶体结构，发现它形成一个二聚体，每个单体由两个结构域组成。N端结构域（氨基酸残基1-238）含有一个保守的DGQQR motif，参与对NTP的水解，而C端结构域（氨基酸残基239-596）含有一个NHN motif，类似于我们研究过的SspE蛋白（高海燕等，2022，Nature Communications）。

核苷酸水解酶检测实验表明，DndI蛋白表现出ATP水解酶活性，加入含硫修饰的GAAC/GTTC序列DNA会增强DndI的ATP水解酶活力。将DndI的N端结构域中的DSQQR motif中的R突变为A会使DndI丧失ATP水解酶活性。同时，DndI表现出核酸缺刻酶活性，可以将超螺旋双链DNA缺刻成开环形式并最终转变为线性形式。将其C端结构域的HNH motif中的N541突变为A会破坏DndI的核酸缺刻酶活性。通过与SspE蛋白的序列比对和结构比较，我们发现DndI蛋白的N端结构域也含有一个识别硫修饰DNA的疏水坑。将疏水坑中的Y25残基用A替代的突变DndI蛋白仍然保留ATP水解酶活性，但是不再能受到硫修饰DNA的调控。

非变性凝胶电泳（EMSA）实验结果表明，DndI的C端结构域对DNA的亲和力是全长DndI蛋白的14倍，这表明DndI的N端结构域对于C端结构域结合DNA有抑制作用。通过构建YFP-DndI-CFP融合蛋白并进行荧光能量共振转移（FRET）实验，我们发现ATP的加入会增强YFP的荧光发射，降低CFP的荧光发射，这表明DndI的N端结构域与C端结构域之间的距离缩短了，而不能水解的ATP类似物AMP-PNP的加入不会造成FRET信号的改变。我们总结得到的结论是硫修饰DNA会被DndI的N端结构域的疏水坑识别，激活N端结构域的ATP水解酶活性，而ATP的水解会触发DndI的构象变化，从“开放”构象转变为“关闭”构象，DndI的N端结构域离C端结构域更加靠近，抑制C端结构域与DNA结合，从而使得DndI从细菌自身的硫修饰基因组DNA上解离，避免对自身基因组造成损伤。另一方面，外源侵入的噬菌体DNA上不含有硫修饰，不会触发DndI对ATP的水解和DndI蛋白构象变化，DndI通过C端结构域结合并缺刻噬菌体DNA，从而实现对于噬菌体侵染的抵御。

图：DndI蛋白对噬菌体DNA进行缺刻，从而抵御噬菌体侵染。而细菌自身基因组DNA会触发DndI对ATP水解与构象变化，从细菌DNA上解离，从而保护细菌自身DNA不受损伤。

文章链接：https://academic.oup.com/nar/advance-article-abstract/doi/10.1093/nar/gkae1133/7913145?utm_source=advanceaccess&utm_campaign=nar&utm_medium=email