近日，上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室的吴更教授团队采用蛋白质结构预测与蛋白质改造设计相结合的方法，基于天然的人结节性硬化症蛋白质复合物tuberous sclerosis complex（简称TSC），改造设计了一种有着与TSC相当甚至更强的抑制Rheb与mTORC1活性、但是大小只有TSC复合物的十五分之一与九分之一的两种蛋白。论文发表在Protein Science上。

mTOR信号通路是真核生物中一种重要的信号传导通路，在从酵母到人类等多种生物中调节细胞生长和代谢。结节性硬化症复合物TSC是mTOR信号通路中的主要负调控因子，通过促进小GTPase蛋白Rheb上的GTP水解为GDP，来抑制Rheb对mTOR的激活，从而抑制细胞增殖，促进细胞自噬等分解代谢过程。TSC复合物由2分子TSC1亚基、2分子TSC2亚基、1或2分子TBC1D7亚基组成，分子量约700 kDa。文献表明抑制mTOR信号通路具有治疗癌症或延长寿命的前景。

该研究首先采用AlphaFold2方法得到了TSC复合物与Rheb的复合物预测结构。通过对该团队前期解析的TSC复合物电镜结构（2020，Journal of Molecular Biology）以及该研究得到的TSC-Rheb复合物预测结构的深入分析，发现TSC2的稳定化结构域在TSC2的GAP结构域对Rheb的结合中起到了非常重要的稳定作用。基于这个发现，该研究改造设计了一个可以负调控Rheb与mTOR的人造蛋白，包括TSC2的稳定化结构域的缩短版本（将连接稳定化结构域的三个区段的两个长loops换为人工设计的短loops）、TSC2的GAP结构域和一个膜定位序列，将其称为Short Stabilization domain-GAP domain-Membrane Targeting Motif （简称SSG-MTM）。与TSC复合物相比，SSG-MTM蛋白大大缩小，只有48 kDa，约是TSC复合物分子量的十五分之一，表现出比TSC复合物更强的稳定性。在体外GAP活性实验、细胞水平的mTOR活性实验、细胞自噬实验、细胞分解代谢实验中，SSG-MTM均表现出比全长TSC复合物同样或更强的促进Rheb上GTP水解为GDP的活性、对mTOR激酶活性的抑制、促进细胞自噬与分解代谢的活性。该研究改造设计的另一个蛋白SSG-TSC1N（采用TSC1蛋白的N端结构域来代替膜定位序列MTM，大小为77 kDa，约为TSC复合物分子量的九分之一）也具有类似的性质。

总的来说，该研究通过（1）对TSC蛋白复合物冷冻电镜结构以及其与Rheb的复合物预测结构的分析，揭示了TSC复合物识别其底物蛋白Rheb的机制；（2）在此基础上，改造设计了一个只有天然人TSC复合物的十五分之一与九分之一大小、然而仍具有与TSC复合物相当甚至更强的抑制mTOR通路活性的两种蛋白。改造设计的这些mTOR信号通路拮抗蛋白为进一步开发以mTOR为靶标的抗肿瘤或延长寿命的蛋白药物奠定了基础。

该研究成果以“Design of negative-regulating proteins of Rheb/mTORC1 with much reduced sizes of the tuberous sclerosis protein complex”为题发表在《Protein Science》期刊上。吴更教授为通讯作者，付文诚为第一作者。该论文是吴更课题组继肿瘤抑制蛋白APC与Asef的复合物（2012，Cell Research）、肿瘤抑制蛋白Sufu与Gli1的复合物（2013，Nature Communications）、APC与Amer1的复合物（2015，Cell Discovery）、TSC复合物中两个亚基TSC1与TBC1D7的亚复合物（2016，Journal of Molecular Cell Biology）、mTOR通路中的CASTOR1与精氨酸的复合物（2016，Cell Discovery）、肿瘤抑制蛋白MOB1与Ndr2的复合物（2017，Nature Communications）、mTOR通路中的Ragulator复合物（2017，Cell Discovery），人全长TSC复合物的冷冻电镜结构（2020，Journal of Molecular Biology）之后，在癌症相关蛋白领域的又一工作。

图1.该研究所改造设计的SSG-MTM蛋白与Rheb蛋白的复合物预测结构。MTM为Rheb来源的结合在溶酶体膜上的膜定位序列。SSG-MTM蛋白只有天然TSC复合物的十五分之一大小