近日，上海交通大学生命科学技术学院/微生物代谢国家重点实验室的吴更教授团队与武汉大学王连荣、陈实教授团队合作，阐明了链霉菌等细菌通过DNA上的磷硫酰化修饰激活细菌中SspE蛋白的核酸酶活性，对侵入细菌的噬菌体DNA进行缺刻，从而抗噬菌体侵染的结构和功能机理。这项研究阐明了细菌如何通过DNA磷硫酰化修饰激活SspE蛋白来实现对噬菌体侵染的抵御功能，加深了人们对于DNA磷硫酰化修饰的功能的认识。该研究成果以“A coupled recognition-activating nicking mechanism underlying the DNA phosphorothioate-sensing antiphage defense barrier by SspE”为题发表在《Nature Communications》上。吴更与王连荣、陈实教授为共同通讯作者。本文是吴更团队自2018年Nature Communications上发表的细菌识别DNA硫化修饰的结构机理、2020年Nature Microbiology上发表的II型DNA硫化修饰的SspB和SspE结构、2020年mBio上发表的II型DNA硫化修饰的SspA结构、2022年mBio上发表的I型DNA硫化修饰的DndE结构的延续和扩展。

DNA磷硫酰化修饰包括两种类型：由dndABCDE基因簇编码的蛋白介导的双链I型修饰和由sspABCD基因簇编码的蛋白介导的单链II型修饰。SspE是由sspABCD基因簇近旁的sspE基因编码的一个核酸酶，长度为700-800氨基酸，由有GTPase活性的N端结构域（NTD）和有缺刻核酸酶活性的C端结构域（CTD）组成。

首先，这项研究通过解析链霉菌SspE的CTD结构域的2.7埃分辨率晶体结构和全长SspE蛋白的3.4埃分辨率晶体结构，发现SspE的NTD和CTD结构域分别形成独立折叠的三级结构，NTD和CTD之间由一段较短的loop连接，而NTD和CTD之间没有很紧密的结合。SspE的NTD含有DGQQR motif，识别并水解GTP。Ssp的CTD含有HNH motif，可以把共价闭环（covalently closed circular）DNA缺刻为开环（open circular）DNA，将SspE-CTD上的HNH motif进行突变会使得其失去对噬菌体侵染的抵御功能。

然后，该研究通过分子对接计算与定点突变体的GTPase酶活性实验，发现SspE通过NTD结构域表面上的一个较为疏水的结合口袋识别细菌磷硫酰化修饰DNA，而对这个硫化DNA结合口袋上的氨基酸残基进行突变会破坏SspE的GTPase酶活性与对于噬菌体侵染的抵御功能。

接着，该研究通过非变性凝胶电泳迁移实验，发现SspE的CTD结构域可以与噬菌体DNA结合，而将SspE-CTD上一个保守的、带正电荷的凹陷表面上的重要残基进行突变会破坏SspE与噬菌体DNA的结合，并会使得SspE失去对噬菌体侵染的防御功能。而且，SspE的CTD对DNA的结合依赖于其NTD对于GTP的水解。

最后，有意思的是，该研究发现R100E突变会使得SspE失去GTPase酶活性与对DNA的缺刻酶活性，然而R100位点并不在GTPase酶活性位点或DNA缺刻酶活性位点上。于是，本研究解析了SspE-R100E突变体的3.48埃分辨率晶体结构，发现与野生型SspE相比，SspE-R100E突变体的CTD结构域朝向NTD结构域整体移动了2.6-3.9埃的距离，这表明SspE存在两个结构域之间相对运动所导致的构象变化。通过荧光共振能量转移实验证实了对细菌磷硫酰化修饰DNA的结合以及对GTP的水解确实会让溶液中的SspE蛋白产生构象变化。

图：细菌硫化修饰基因组DNA激活SspE的核酸酶活性，对噬菌体DNA进行缺刻切割，以抵御噬菌体侵染的机理

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-34505-0