近日，中国科协和美国科学促进会共同创办的综合性科技期刊《Research》在线发表了上海交通大学生命科学技术学院肖华课题组与合作者的研究论文《肺癌口腔微生物组的宏蛋白质组学深度分析》（In-Depth Metaproteomics Analysis of Oral Microbiome for Lung Cancer）。该论文创建了宏蛋白质组学研究新策略，从微生物功能的执行者——蛋白质的水平对微生物组开展了深入探究，实现了口腔微生物组的深度宏蛋白质组学解析，并为发现肺癌与微生物组紊乱之间的关系提供了新线索。该研究论文以上海交通大学为第一单位，上海交通大学生命科学技术学院博士毕业生姜晓腾和药学院张岩副教授为该论文的共同第一作者，上海交通大学生命科学技术学院肖华教授、电子信息与电气工程学院曹成喜教授、美国加州大学洛杉矶分校牙科学院胡深教授为该论文的共同通讯作者。

图1.口腔微生物组的宏蛋白质组学研究新策略

人类微生物组在维持体内稳态方面发挥着重要作用。作为人体内的第二大微生物菌群，口腔微生物组包含近800种微生物，非冗余基因多达2000万个。口腔微生物组作为连接外部环境与人体消化道和呼吸道的第一道枢纽，其组成和功能对人体内共生微生物的构成至关重要，其失调可导致包括肺癌在内的多种人体系统性疾病。因此，对口腔微生物组开展深入研究具有重要意义。目前，大多数肺癌相关的微生物组研究都是通过测序方法进行的，而基于物种分类变化的分析往往不能准确反映其功能上的改变。对微生物组的功能特性进行表征是理解其在疾病中发挥作用的关键因素。功能分析依赖于蛋白质检测，这是基于质谱的宏蛋白质组学的优势。

然而，口腔微生物的宏蛋白质组学研究目前还处于初级阶段，其面临的挑战主要包括：(1)口腔微生物组样本中包含大量宿主蛋白、细胞和细胞碎片，背景干扰严重；(2)口腔微生物的组成结构复杂，缺少制备型微生物分离技术，使海量微生物肽段极易造成液相色谱-质谱的分离检测达到饱和；(3) 口腔微生物的丰度动态范围宽，低丰度菌群易被掩盖，极大限制了对低丰度物种的表征，往往需要依赖微生物培养，不利于不可培养微生物的分析；(4)缺乏高效的口腔微生物宏蛋白质组数据分析流程。这些因素严重阻碍了对口腔微生物组的深度解析。为突破以上瓶颈，研究人员发展了微生物样本预处理新策略，构建了高分辨自由流等电聚焦电泳技术，实现了复杂微生物的分离、富集和制备，显著提高了液相色谱-质谱对微生物组的蛋白质解析和鉴定能力，同时建立了整合的宏蛋白质组学分析模块，为深度挖掘微生物组的物种组成和其执行功能提供了全面的分析策略。

图2.基于自由流等电聚焦电泳的宏蛋白组学鉴定结果

图3.宏蛋白质组学分析微生物组的物种分类和功能

研究人员首先在样品前处理阶段利用差速离心和双滤膜过滤法，有效地将样品中的宿主细胞和蛋白与微生物进行分离，显著降低了宿主蛋白对微生物鉴定的干扰，提高了微生物的蛋白鉴定数量和实验重现性。其次，研究人员构建了适合复杂微生物分离制备的电泳体系，同时实现了对低丰度微生物的富集，进一步提升了微生物蛋白的鉴定效率，将口腔微生物蛋白的鉴定数量提高了新水平。再次，通过整合的宏蛋白质组学数据处理工具，研究人员不仅对口腔微生物组的蛋白质功能进行了探究，还对微生物的物种构成和各物种所执行的功能进行了联合分析。最后，研究人员系统比较了肺癌患者口腔微生物组与正常对照组的差异，发现并验证了两种在肺癌中执行紊乱功能的口腔微生物。该研究创建的宏蛋白质组学新策略将有助于全面分析复杂微生物组所执行的功能，并为深入探究微生物组与疾病的关系提供了新工具。

图4.肺癌组与正常对照组口腔微生物分析

该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金面上项目、基金委国家重大科研仪器研制项目、上海市自然科学基金等项目支持。

论文链接：https://spj.sciencemag.org/journals/research/2022/9781578/