近日，上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室冯雁团队在分子诊断领域权威期刊《Biosensors and Bioelectronics》上发表题为“Argonaute-integrated isothermal amplification for rapid, portable and multiplex detection of SARS-CoV-2 and influenza viruses”的研究论文。该工作利用高温菌Argonaute（Ago）基因编辑酶的级联剪切机制，结合快速等温扩增，建立了新型多重快速核酸检测平台技术—MULAN (Multiplex Argonaute-based Nucleic Acid Detection)，实现了新冠及流感病毒样本的高灵敏度、高特异性、快速的便携式检测。上海交通大学生命科学技术学院博士生叶星宇、中国食品药品检定研究院周海卫研究员为该论文共同第一作者，冯雁教授、许四宏研究员、刘倩副研究员为共同通讯作者。研究工作由上海交通大学、中国食品药品检定研究院、浙江科技学院、人和未来生物科技有限公司、万孚生物技术股份有限公司、上海交通大学附属瑞金医院等合作完成。

核酸检测在新冠等传染性疾病诊疗中发挥着重要作用, 目前对高灵敏度、快速、居家检测的需求尤为迫切，以解决专业人员短缺、检测结果等候时间长和检测可靠性低等问题。近年来，CRISPR为代表的基因编辑酶（Cas12/13）核酸检测技术，解决了核酸检测中的假阳性、可视化等问题，被誉为“下一代分子诊断技术”，然而该体系存在引导链RNA合成昂贵且易降解、多重检测反应体系复杂等诸多问题，限制了其临床应用。

冯雁教授团队探索了高温微生物Pyrococcus furiosus Argonaute 核酸酶（PfAgo）对DNA的催化作用，发现其次级剪切机制，以及对单碱基差异靶标序列精准识别的规律。该工作中，作者建立了Ago-环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）偶联的多重核酸检测平台技术。其原理是，首先65 oC对病毒核酸样本进行快速等温扩增，然后与高温Ago剪切体系混合，巧妙利用剪切产物DNA介导荧光标记DNA分子的次级剪切，产生相关病毒的荧光报告信号（图１）。研究表明Ago精准剪切作用有效地解决了LAMP非特异扩增造成的假阳性问题。以新冠病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒为检测对象，通过设计3组不同的特异性短链guide DNA与探针，建立多重检测体系,实现了单酶对多重病毒核酸产物的精准识别，临床样本阳性符合率达到100%。

图1. MULAN技术多重检测工作原理

研究人员还针对新冠病毒单碱基突变株设计了高效的分型检测方法。以新冠病毒及其D614G突变株为对象，巧妙地在荧光报告基因上引入单点错配，提高Ago的靶标精准识别能力，实现了区分野生型和突变毒株的分型诊断（图2）。在野生型和突变株基因不同混合比例的样本测试中，MULAN可检出5%的突变频率，即可区分20：1混合样本中有一份的突变病毒，具有高度特异性。

图2. MULAN技术检测新冠及其单碱基突变株的示意图

研究团队开发并验证了配套的便携式核酸即时检测的设备与耗材（图3A），实现了扩增-剪切“一管式”反应，避免了CRISPR两步法检测的开盖步骤，有效控制了环境污染。整个反应时间控制在45分钟以内，较RT-qPCR时间（约80分钟）更短，最低可检出320 拷贝/毫升。MULAN技术还可结合胶体金免疫层析和蓝光激发荧光效应，直接通过肉眼观察判定检测结果（图3B）。

图3. MULAN技术与便携式检测设备（A）、检测试纸及蓝光照射（B）结合

总之，MULAN检测平台技术为病原体多重核酸检测领域提供了一种极具前景的解决方案。与现有的检测技术相比，它具有快速、准确、经济的优势，尤其是多重检测的简便性和安全性优于目前报道的先进的CRISPR技术；MULAN技术与恒温检测设备、检测试纸及蓝光照射等结合，降低了对昂贵仪器设备（qPCR仪等）的依赖，其便携性为新冠等传染性疾病的居家检测和基层检测等提供了新方案。研究成果不仅对传染病防控产生积极影响，也可应用于对其他重大疾病诊断。合作单位交弘生物科技（上海）有限公司承担相应技术转化及产品开发。

本研究得到了国家自然科学基金面上项目（31770078）、科技部重点研发计划（2020YFA0907700）、上海交通大学“交大之星”计划医工交叉研究基金（20X990010002）和浙江大学防治新型冠状病毒肺炎应急科研项目（2020XGZX022）的支持。

论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566322002093?dgcid=coauthor

团队介绍：

冯雁教授团队聚焦分子酶学和合成生物学研究。近年来针对疾病分子诊疗方面的酶学需求，探索了微生物Agonaute 核酸酶的催化特性与进化相关性，揭示了酶对单碱基差异靶标序列精准识别的规律，创建了具有自主产权的肿瘤核酸富集和检测“A-Star”（Nucleic Acids Research, 2021, 49(13), e75）、病原微生物核酸检测“RADAR”（Bioresources and Bioprocessing, 2021, 8, 46）等系列新技术，突破了对国外CRISPR酶检测技术的依赖性，为保障人类健康、食品安全、动物检疫等行业发展提供理论和技术支撑。