冯雁教授团队在微液滴酶超高通量筛选领域获突破性进展

近日,分析化学领域的著名杂志Analytical Chemistry在线刊登了上海交通大学生命科学技术学院冯雁教授团队在酶超高通量筛选体系构建方面的突破性进展“Substrate Engineering Enabling Fluorescence Droplet Entrapment for IVC-FACS Based Ultrahigh-Throughput Screening”(DOI: 10.1021/acs.analchem.6b01712),马富强博士为第一作者,杨广宇副研究员为通讯作者,加拿大不列颠哥伦比亚大学Stephen G. Withers教授和Michael Fischer博士为共同作者。

定向进化是探索酶催化机制和对酶功能进行重塑的重要技术途径,目前影响其成功关键瓶颈之一是缺少有效的高通量筛选方法。研究团队在以往的工作中建立了基于微液滴反应器的酶超高通量筛选体系,其筛选速度可高达108个克隆/天,比常规的孔板法筛选快1000倍以上,同时极大地降低了昂贵的荧光底物的消耗(PloS One. 2014, 9(2): e89785)。然而由于许多商品化荧光底物在微液滴反应器无法很好的保留,造成荧光信号在微反应之间发生扩散,导致筛选准确度降低、效率下降,使得该体系的应用范围受到了限制。

为解决此问题,研究团队提出了一种被称作“荧光液滴捕获(Fluorescence Droplet Entrapment, FDE)”的酶底物设计新策略。他们通过调节底物和产物分子疏水性的变化,来控制分子在微液滴内的扩散行为,从而提高筛选体系的准确度。具体来说,经过FDE设计的底物分子结构具有较高的疏水性,可以自由通透油相进入微液滴内部与酶进行反应;在酶促反应后,底物被转化为具有较高亲水性的荧光产物,由于其高亲水性,荧光产物被困在微液滴内部无法扩散出,从而可以准确地定量反映微液滴内部的酶活性。在使用磷酸三酯酶进行的模式筛选实验中,经过单次筛选即可将阳性细胞在大量无酶活性的阴性细胞中富集900倍以上,显示了FDE底物设计方法的高效性。本研究还进一步探讨了FDE底物设计方法的通用性,对于酯酶、脂肪酶、磷脂酶、糖苷酶、蛋白酶、肽酶等重要工业酶的FDE底物设计方案提出了建议,为进行更大规模的酶快速定向进化铺平了道路。

 

 

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